 Il est le fils de Leopold Landsteiner, un journaliste et éditeur de revues, ainsi que juriste. Lorsque Karl a six ans, son père décède et il est élevé par sa mère, Fanny Hess.
En 1891, il obtient un diplôme de médecine à l'université de Vienne. Comme il a étudié chez Emil Fisher et d'autres, il a également une solide formation en chimie.
En 1908, il devient professeur de pathologie à l'Université de Vienne. En 1916, il se marie avec Helen Wlasto, et leur couple aura un fils. Suite à la Première Guerre mondiale, il quitte l'Autriche pour les Pays-Bas. En 1922, il rejoint l'Institut Rockefeller (Rockefeller Institute for Medical Research) à New York, et y reste pour le restant de ses jours (même après sa retraite en 1939).
Au cours de cette période, il devient citoyen américain. Karl Landsteiner décède d'une attaque cardiaque alors qu'il travaillait dans son laboratoire.
On lui doit le développement en 1909 du système moderne de classification des groupes sanguins, ainsi que l'immunochimie des haptènes. En 1940, en collaboration avec Alexander Wiener, il identifie le facteur Rh, responsable de la maladie hémolytique du nouveau-né.
Il a reçu le Prix Nobel de médecine en 1930 pour ses travaux sur les groupes sanguins. Karl Landsteiner est devenu membre étranger de la Royal Society le 29 mars 1941.
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